Terapia Epigenómica para H1N1

Tema: La histona desmetilasa LSD1 restringe la infección por el virus de la gripe A mediante el borrado de la monometilación IFITM3-K88
Mecanismo epigenómico tratado: Metilación de ADN, Histona desmetilasa.
Como se lo hizo: Para probar el efecto de LSD1 en la actividad IFITM3 hacia la infección por virus, las células HEK293T se trans infectaron con IFITM3 y LSD1 y luego se infectaron con VSV.  Para examinar la actividad células IFITM3, las células A549 fueron infectadas por el virus de la gripe A, shSET7 y shLSD1 derribaron eficientemente los niveles de expresión génica de SET7 y LSD1 respectivamente; mientras que la expresión de IFITM3 no se vio afectada.
Resultados: 

• Un inhibidor de LSD1 desencadena un resultado más grave de la enfermedad en ratones infectados por IAV 
• La desmetilación de IFITM3 por LSD1 es beneficiosa para el huésped para luchar contra la infección por el virus del ARN.
• LSD1 limita la replicación del virus del ARN mediante la desmetilación y activación de IFITM3
• La metilación de lisina y la desmetilación de IFITM3 en K88 para mantener la homeostasis celular. (1)

Referencias bibliográficas: 

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5760097/

Terapia de edición de ácidos nucleicos para H1N1

 Tema:  Cápsulas híbridas inorgánicas-orgánicas para una administración intracelular eficiente de nuevos siRNA contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1)
Tipo de edición: In vivo / Ex vivo ( Célula somática)
Dirigido hacia: 

• ARN de sentido negativo
• ARNi se activa cuando los dsRNA cortos (21 nucleótidos de longitud), llamados ARN interferentes cortos (siRNAs) se incorporan al complejo de silenciamiento inducido por ARN enzimático (RISC), donde una helicase desenrolla el siRNA dúplex. 
• siRNAs (NP-717, NP-1155 y NP-1496)
• NP-1496 siRNA

Dirigido por: 

•  Replicación de virus pueden estar dirigidos con ARNi
• rNPs  asociación con otras proteínas virales
• oligonucleótidos de ARN sintetizados por "DNA-synthesis"
• PA-1630-FAM

Órgano a tratar: Células epiteliales pulmonares
Vía de administración:  administración intracelular de ares de siRN contra la gripe A mediante SiO2-cápsulas híbridas recubiertas.

Resultados: 
Corto p: La inhibición de la producción de virus de la gripe en líneas celulares infectadas (MDCK y A549).

Medio p: Las microcápsulas actúan como un depósito para la liberación y permiten controlar la liberación de agentes terapéuticos en lugares específicos y en el momento deseado en estímulos internos o externos. 

Largo p: Las cápsulas tienen muchos atributos que prestan a su aplicación en biomedicina, estas cápsulas no son tóxicas y poseen propiedades biodegradables, para la implementación biológica y la entrega de diferentes compuestos bioactivos. (1)

Referencias bibliográficas: 

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5427965/ 

Terapia con stem cells para H1N1

Las células madre de las vías respiratorias distales p63Krt5 son esenciales para la regeneración pulmonar

Tipo de Stem cells:

- células madre de vías respiratorias distales (DASCp63/Krt5  Y  TBSCp63/Krt5 )

Métodos  de obtención: 

-los TBSC y DAC in vitro y sus homólogos in vivo

-aislar las células madre de las vías respiratorias, la tráquea y el pulmón

-las colonias de una sola célula fueron recogidas por clonación de anillos y expandidas.

-Para activar lacZ en TBSC y DASC exponemos colonias in vitro a 4-OH-tamoxifeno

-Los TBSC se cultivaron en cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) para la diferenciación

-Células madre se ampliaron en cultivo y se cosecharon mediante la trippsinación diferencial. 

Vías administración: 

-Inyección intraperitoneal 

-La administración intratraqueal se realizó pipeteando el virus directamente en la laringe/tráquea.

Resultados a corto, medio y largo plazo. 

-Corto p: Deneter la expansión proliferativa en respuesta al daño pulmonar inducido por la gripe

-Medio p: Capacidad de propagar estas células manteniendo su compromiso de linaje intrínseco

-Largo p: se generaron colonias de células madre de vías respiratorias distales con auto-renovación a largo plazo y terapias basadas en células madre para enfermedades pulmonares agudas y crónicas.

Fuente: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7095488/

Ejemplo de recombinaciòn de àcidos nuclèicos en la naturaleza, ADN recombinante artificial H1N1 y Ejemplo de transgènico animal .

Ejemplo de recombinaciòn de àcidos nuclèicos en la naturaleza

El entrecruzamiento cromosómico es el intercambio de material genético que se produce en la línea germinal. Durante la formación de óvulos y espermatozoides, un proceso también conocido como meiosis, los cromosomas emparejados de cada progenitor se alinean de manera que las secuencias similares de ADN de cada pare de cromosomas se puedan cruzar entre sí. El entrecruzamiento cromosómico genera una mezcla del material genético y es una causa importante de la variación genética observada en la descendencia. (1)

 ADN recombinante artificial H1N1

T: Producción de las proteínas recombinantes NS1 y NEP del virus de la influenza A H1N1 en Escherichia coli, purificación y obtención de anticuerpos monoclonales.
O: Elaborar las proteínas recombinantes NS1 y NEP, purificarlas y utilizarlas como antígenos para producir anticuerpos monoclonales. 
G:  genes M y NS
E.R.: PA tiene actividad de endonucleasa.
E.L.: Ligasa T4
V: pQE-80L
C.R.: E. coli: BL21-NEP y BL21-NS1
M.T.G.: Transformaciòn
M.I.C.: Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida, Western-blot, Determinación de proteínas por el método de Sedmak y Grossberg, Cromatografìa, Cultivo. (2)

 

Ejemplo de transgènico animal 

Los animales transgénicos son animales a los cuales se les añade un gen que codifica para una proteína que ejercerá una función inexistente en el animal silvestre. A) Salmón transgénico, al cual se le añadió el gen modificado de la hormona del crecimiento, que se expresará permanentemente, por lo que el salmón transgénico llega a medir más del doble de un animal silvestre. B) Salmón silvestre que deja de expresar la hormona del crecimiento en agua con temperaturas bajas; se observa una diferencia marcada en el tamaño con respecto al transgénico. (3)

Fuente: 
1. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Entrecruzamiento-cromosomico
2. https://repositorioinstitucional.buap.mx/bitstream/handle/20.500.12371/634/759217T.pdf?sequence=1&isAllowed=y
3. https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1473&sectionid=102745612

Tècnica molecular epigenòmica microarrays de miRNAs para H1N1

Tema: Anàlisis de microarrays de expresion de microARN en celulas mononucleares de sangre perifèrica de pacientes crìticamente enfermos con influenza A (H1N1). 

Objetivo: Identificar las diferencias sistemáticas en los patrones de expresión de miARN entre PBMC de pacientes críticamente enfermos por H1N1.

Muestra: Las muestras de sangre se recogieron en tubos tratados con EDTA

Mètodos: 

1. Identificamos miARN celulares involucrados en la respuesta del huésped a la infección por el virus de la influenza mediante la realización de un perfil completo de miARN en células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

2. Ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (qRT-PCR). Se realizó un análisis de la curva de características del operador del receptor (ROC) y se calculó el área bajo la curva ROC (AUC) para evaluar la precisión del diagnóstico de la infección grave por el virus de la influenza H1N1. 

Resultados: 

• 41 miARN expresados ​​significativamente diferencialmente mediante microarrays de miARN.
• El ensayo QRT-PCR y los análisis de la curva ROC revelaron que miR-31, miR-29a y miR-148a tenían todos un valor de diagnóstico potencial significativo para pacientes críticamente enfermos infectados con el virus de la influenza H1N1, que arrojaron AUC de 0,9510, 0,8951 y 0,8811, respectivamente.
•  La expresión de la cinasa 2 de Janus, la cisteína peptidasa relacionada con la apoptosis de la caspasa 3, la interleucina 10 y la resistencia 1 al mixovirus aumentaron extremadamente en pacientes críticamente enfermos.

Fuente:

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3679792/

Prueba de tamizaje y confirmatoria para H1N1

Prueba de Tamizaje

Se utiliza como prueba de tamizaje y como apoyo en el diagnóstico de infecciones virales por Influenza A y B, cualquier muestra reactiva con la prueba rápida ad bio Influenza A/B debe ser confirmada a través de la aplicación de métodos alternativos de ensayo. La prueba rápida ad bio Influenza A/B es una prueba de inmunológica de antígeno, la cual proporciona un resultado de prueba instantáneo sin necesidad de instrumentación o requerimientos técnicos de laboratorio.

Prueba confirmatoria 

las pruebas confirmatorias (rRT-PCR o cultivo) de presencia o ausencia de virus de influenza necesitan entre dos y siete días para obtener los resultados. Se encontró una prevalencia de influenza confirmada por laboratorio de 72% basada en cultivo viral y 79% basada en reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa reversa (rt-pcr). rRT-PCR para influenza A su sensibilidad es 92%

Fuente: 

1. http://www.annardx.com/productos/images/productos/diagnostica/pruebas-rapidas/ad0187s-influenza-ab-rev-dpdf.pdf

2. https://scielosp.org/article/rpsp/2011.v29n1/01-08/

3. https://www.medigraphic.com/pdfs/atefam/af-2018/af183g.pdf

Hibridación de la influenza

La hibridación in situ de fluorescencia de ARN para ARN virales de la gripe, un método utilizado para analizar las distribuciones y el tráfico de ARN virales en células infectadas con especificidad de segmento. La hibridación usando 20 o más sondas cortas de ADN marcadas con fluorescencia permite la detección de ARN virales con sensibilidad de molécula única. 

Fuente:

1. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30151575/